T.R. Knight est né le 26 mars 1973, à Minneapolis, Minnesota, USA.
En 2002, il joue le rôle de Daniel dans « Garmento ». Il interprète ensuite le personnage de Ryan Lemming dans la série « Charlie Lawrence » en 2003. Il apparaît dans un épisode de « Frasier » la même année et en 2004, joue le rôle de Neil Colby dans « Law and Order ». Il apparaît également dans un épisode des « Experts » en 2004 et rejoint le casting de « Grey’s Anatomy » dès 2005 sous les traits de George O’Malley.